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慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種，其感染的顯著特點是感染個體在出現典型的臨床癥狀之前，大多經歷長達數年的潛伏期，之后緩慢發病，因此這些病原體被稱為慢病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV，至少有HIV-1和HIV-2兩個亞型）、貓免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒（BIV）等。

慢病毒基因組為雙鏈RNA，但區別于一般的逆轉錄病毒，慢病毒具有更廣的宿主范圍，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。重組慢病毒載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎發展起來的工具載體，其毒性基因已經被剔除并被外源目的基因所取代，屬于假型病毒（一次性感染能力而無復制產生新病毒能力）。慢病毒可將靶基因整合到宿主的基因組中，并且能夠在細胞系中穩定表達，可以進行穩轉細胞株的篩選。被廣泛應用于各種細胞系基因敲除、基因過表達和RNA干擾等。

HIV-1結構

HIV-1 RNA長度約為9 kb，碼了9個蛋白，分別是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三個更大的閱讀框編碼了三個最主要的結構蛋白：gag、pol和env。

gag — 編碼病毒核心蛋白，包括基質蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等；             

pol — 編碼病毒復制所需的酶，如反轉錄酶、整合酶和蛋白酶；

env — 編碼包膜蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性；    

tat — 基因反式激活因子，與病毒的LTRs結合后促進病毒基因的轉錄；

rev — 病毒蛋白表達調節因子，調節gag、pol和env的表達水平；

vif, vpr, vpu和nef — 4個輔助因子，編碼的蛋白作為毒力因子參與宿主細胞的識別和感染；

 LTR — 長末端重復序列（long terminal repeat），內含復制所需的順式作用元件；病毒基因轉錄啟動子；對慢病毒的轉錄、逆轉和整合進入宿主細胞基因組都是必須的。

Ψ — 位于5'-LTR和gag基因之間，是病毒基因組二聚化和包裝的必須信號。

圖1. HIV-1病毒基因組

重組慢病毒系統

重組慢病毒系統是基于HIV-1病毒建立的工具系統，其將HIV-1基因組中的“順式作用元件（如包裝信號ψ、LTRs）”和“編碼反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等）”進行分離，變為載體成分和包裝成分。

“載體成分”包含了HIV-1包裝、逆轉錄和整合所必須的順式作用元件（LTRs，ψ等），并且兩個LTRs間插入我們需要表達的目的序列（目的基因cDNA，shRNA或miRNA等）。

“包裝成分”是去除HIV-1包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列，留下的能編碼反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等），可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。出于生物安全性考慮，將慢病毒的反式作用元件gap、pol、rev、env和tet等基因用輔助質粒表達。

慢病毒的包膜蛋白決定了感染細胞的類型。由于HIV-1病毒的env蛋白只能識別CD4受體，早期的HIV載體所能感染的宿主范圍非常狹窄。病毒載體可以借助其他病原體的外殼蛋白包裝成假病毒，以改變其嗜性，最常用的是皰疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G）。VSV-G有兩個明顯的優勢：(1) VSV-G蛋白比env蛋白更加穩定，因此通過VSV-G蛋白“假型化”的病毒可以進行超離濃縮，從而獲得更高的滴度。(2) VSV-G的受體是在細胞膜上廣泛表達的磷脂酰絲氨酸，因此相較于env蛋白，VSV-G“假型化”病毒宿主范圍變得更加廣闊。目前，絕大部分慢病毒載體均采用VSV-G作為包膜蛋白。

慢病毒包裝系統

現在常用的包裝系統為第二代慢病毒系統（即三質粒系統）和第三代慢病毒系統（即四質粒系統）。第二代慢病毒系統含有3個質粒，第三代慢病毒系統含有4個質粒。這兩代病毒系統都含有以下相同的成分：

1，編碼目的序列的轉移質粒（Transfer Plasmid）。目的序列可以是我們感興趣的目的基因，shRNA或者gRNA-Cas9序列等。Transfer Plasmid其實就是我們自己構建的含有目的序列的慢病毒載體質粒。目的序列的兩側都含有LTR，LTR可以輔助目的序列插入到宿主細胞的基因組中。通常，病毒轉導后整合到宿主基因組中的是LTR之間的序列，包括LTR。慢病毒質粒是基于HIV-1病毒改造的，為了安全目的，這些Transfer Plasmids都里不能復制，并且它們的3'LTR序列有所刪減，這樣病毒插入到基因組后會自我失活（self-inactivating，SIN）。

2，包裝質粒（Packaging Plasmid），編碼病毒的核心蛋白、復制所需的酶和基因表達調節因子等。

3，包膜質粒（Envelope Plasmid），編碼蛋白質外殼。

第二代慢病毒系統：

圖2. 第二代慢病毒系統

這個系統含有3個質粒：

第1個質粒：包裝質粒（Packaging Plasmid），它編碼gag，pol，rev與tat基因。刪除了vif, vpr, vpu和nef 4個毒力因子，因其對病毒的致病性是必須的，但去除后不影響病毒的滴度和感染能力。

第2個質粒：包膜質粒（Envelope Plasmid），含有VSV-G序列（用以替換env序列），編碼包膜蛋白。

第3個質粒：轉移質粒（Transfer Plasmid），含有病毒的LTRs和Ψ包裝信號（圖片未畫出），除非有內部啟動子，否則這個Transfer Plasmid的目的序列是由5'LTR驅動的，它是一個弱啟動子，需要Tat元件激活。所有的第2代慢病毒Transfer Plasmid必須要用第2代慢病毒包裝系統，因為它的LTR是Tat依賴性的。而第3代慢病毒包裝系統不能包裝第二代Transfer Plasmid，因為不表達Tat。

第三代慢病毒系統：

圖3. 第三代慢病毒系統

設計第3代慢病毒系統的目的主要還是提高安全性。第3代慢病毒系統，將第2代慢病毒系統的Packaging Plasmid分成了2個質粒，一個編碼rev，另外一個編碼gag和pol。雖然第3代慢病毒包裝系統更為安全，但使用時更麻煩，并且由于添加了一個額外的質粒導致它的效率降低了。除此之外，第3代慢病毒包裝系統刪除了Tat元件，并且Transfer Plasmid 5'LTR被部分刪除并融合上異源增強子/啟動子（如CMV或者RSV啟動子），該啟動子驅動目的序列表達并不依賴于Tat元件。第3代病毒的Transfer Plasmid可以使用第2代或第3代的包裝質粒。

注意：第三代慢病毒包裝系統只能包裝第三代慢病毒轉移質粒，但是第二代慢病毒包裝系統既能包裝第二代，也能包裝第三代慢病毒轉移質粒。

第二代慢病毒系統與第三代慢病毒系統的區別

常用包裝質粒總結

包裝步驟

詳見慢病毒包裝試劑盒（江苑生物 JY03021）說明書。