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慢病毒包裝質粒Mix

Lentiviral Packaging Plasmid Mix

產品貨號：JY03024      規格：100 μg (10T)        銷售價格：￥ 1200

產品貨號：JY03025      規格：200 μg (20T)        銷售價格：￥ 2000

產品貨號：JY03026      規格：400 μg (40T)        銷售價格：￥ 3000

慢病毒包裝質粒Mix.pdf

產品簡介

江苑生物的慢病毒包裝質粒Mix（Packaging Mix）為優化的全套慢病毒包裝輔助質?；旌衔?，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝系統。本產品附贈表達eGFP蛋白的對照質粒（eGFP Control），用于驗證慢病毒包裝效果。本公司還提供慢病毒包裝試劑盒（江苑生物 JY03021），包含全套的包裝組分和試劑。

Packaging Mix能夠表達病毒包裝需要的各種必需成分如：gag基因，編碼病毒的核心蛋白如基質蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等；pol基因，編碼病毒復制所需的酶如反轉錄酶、整合酶和蛋白酶；rev基因，編碼調節gag和pol基因表達的調節因子；還含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。江苑生物的慢病毒包裝系統產生的慢病毒為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。

本產品具有慢病毒包裝時間周期短（一周之內即可獲得純化好的高滴度慢病毒）和病毒滴度高的優勢，可應用于針對不同基因和藥物靶標的細胞學實驗和整體動物實驗。非常適合于病毒包裝初試者。為了加速科研進程，江苑生物還提供細胞基因過表達、shRNA/siRNA介導的基因沉默、CRISPR/Cas9介導的基因敲除等服務。

產品組分

保存條件

干冰運輸。-20℃保存, 避免反復凍融，1年有效。

還需準備的其他實驗材料

1．被包裝的慢病毒載體質粒：在慢病毒包裝前，需要先獲得含有目的序列的慢病毒載體，以無內毒素高純度的試劑盒提取慢病毒載體質粒，并將質粒DNA溶于無菌的TE或ddH₂O中，測定其濃度及純度，保證質粒DNA A260/A280在1.8-2.0之間。

2．慢病毒包裝用293T細胞株：良好的細胞狀態對病毒的包裝至關重要，避免細胞培養基有細菌、真菌或支原體的污染，盡量使用傳代次數較少的細胞，如果細胞是剛復蘇的話，更好傳兩代之后再包裝。

3．細胞培養基，血清和雙抗等

4．質粒轉染試劑

5．其他常用實驗耗材（如10 cm培養皿，離心管等）

使用說明（以10 cm培養皿，為例）：

1．293T細胞分盤：轉染前，將293T細胞以合適的比例傳代到10 cm培養皿中，當細胞長到70%-90%時準備轉染。

注：細胞要充分消化，成團細胞影響轉染效率。

2．轉染前換液：轉染前將293T細胞換成新鮮培養基，10 mL/10 cm皿。現在的轉染試劑例如Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、LipoSuper（江苑生物 JY03051）和其他轉染試劑，多不受血清和抗生素的影響，此處可換為含有血清和抗生素的完全培養基。具體需根據轉染試劑的要求換液。

注：293T細胞貼壁性不是很好，換液時應小心滴加盡量避免沖起細胞。

3．轉染：Packaging Mix：表達目的序列的慢病毒載體質粒=1：1

★ 以使用LipoSuper（江苑生物 JY03051）轉染試劑為例：

取一只無菌的離心管，加入750 μL DMEM（不含血清和抗生素），10 μg 表達目的學列的慢病毒載體質粒（自行提供），和13.5 μL Packaging Mix（10 μg），用槍輕輕吹打混勻；再加入32 μL LipoSuper，用槍輕輕吹打混勻，靜置5 min，請特別注意不可Vortex或離心。將混合液均勻滴加到提前換液的細胞培養基中，輕輕晃勻，置于培養箱中培養，后續無需在數小時后更換培養液。

注：上述混合液室溫存放6 h內穩定。某些細胞對轉染試劑比較敏感，可以在轉染后8-12小時更換細胞培養液，轉染效率無顯著影響。

★ 以使用Lipofectamine 3000（Invitrogen L3000015）轉染試劑為例：

取兩只無菌的離心管，一只加入500 μL Opti-MEM和32 μL Lipofectamine 3000，用槍輕輕吹打混勻；另一只加入500 μL Opti-MEM 和10 μg表達目的序列的慢病毒載體質粒（自行提供）、13.5 μL Packaging Mix（10 μg）及40 μL P3000試劑，用槍輕輕吹打混勻。將兩管液體混合，再次用槍輕輕吹打混勻，不可Vortex或離心，室溫孵育10-15 min。將混合液均勻滴加到提前換液的細胞培養基中，輕輕晃勻，置于培養箱中培養，后續無需在數小時后更換培養液。

注：某些細胞對轉染試劑比較敏感，可以在轉染后8-12小時更換細胞培養液。Invitrogen的Protocol顯示10 cm培養皿Lipofectamine 3000推薦使用21.7 μL或者43.4 μL兩種劑量，自行探索哪個劑量更為合適。本實驗室在檢測該包裝質粒時，選用的劑量為32 μL

4．病毒收集：轉染36 h左右后，吸取上清至新的離心管中，4℃保存。另外添加10 mL新鮮的完全培養基到細胞中，注意不要沖起細胞。再次大約36 h后，收取上清至同一個離心管中。

5．將兩次收集的病毒上清用0.45 μm濾器過濾后轉移到新的離心管中（若沒有0.45 μm濾器，將病毒上清3000 rpm，4 ℃離心5 min，棄沉淀亦可）。此時上清液中的病毒顆?？梢灾苯訖z測滴度或者感染目的細胞，如果對病毒的滴度及純度有較高要求，可對上清液進行濃縮與純化。

注：如果使用濾器過濾，只能使用低蛋白結合力的纖維素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不能用硝酸纖維素膜（NC）。

若上清較多，可以1500 rpm離心5 min，將細胞及碎片離心到管底，再進行過濾，防止堵塞濾器。

過濾時，將注射器與濾器卡緊，輕柔推動活塞，防止用力過度造成濾器崩離注射器，使得病毒液四濺。

6．（可選）慢病毒濃縮：可以使用江苑生物的慢病毒濃縮試劑盒（JY03011）進行慢病毒濃縮，效率更高。同時，也可以自行配制PEG-8000慢病毒濃縮液濃縮慢病毒。

注：慢病毒滴度測定方法參考http://m.jufukemao.com/news/xingyedongtai/179.html （江苑生物官網→新聞中心）

7．病毒分裝與保存：將病毒上清或濃縮后的病毒分裝，保存于-80℃。

注：病毒液一定要分裝，切忌反復凍融，凍融一次病毒滴度將降低20-60%。

圖1 江苑生物與**公司慢病毒包裝試劑盒包裝效率比較

注意事項

1．廢棄的含病毒的培養基中加入84消毒液（1:20左右），浸泡1天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或常規滅菌（121℃，20 min）。

2．本產品僅用于科學研究。

3．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

包裝效率低可能存在的問題

1．優化質粒與轉染試劑比例，對于難轉染的細胞，可適當增加轉染試劑的用量。

2．應使用高純度、無內毒素、無污染物的質粒進行包裝，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范圍內，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染。

3．包裝細胞（例如293T）狀態對病毒的包裝很重要，盡量使用傳代次數較少的細胞。狀態不好的293T可能導致包裝效率降低60%以上。輕柔換液就能導致半數細胞漂起，這樣的293T細胞再高效的包裝試劑盒也無濟于事。請從正規細胞庫購買細胞，借來或者不正規公司獲得的細胞可能會因為傳代次數過多影響包裝效率。避免細胞培養基有細菌、真菌或支原體的污染。

4．表達目的序列的載體質粒過大，會降低包裝效率。載體質粒容納外源基因長度的能力是有限的，盡管理論上，在LTR之間可以插入的基因長度約為8.5 kb，但超過3 kb就會導致包裝效率降低。而整個載體質粒過大，也會導致包裝效率降低，進而影響最后的病毒滴度。若不能控制插入片段的大小，需盡量選擇較小的載體骨架。

5．CRISPR-Cas9質粒中，Cas9基因長度就達4 kb左右，整個載體質粒15 kb左右，故其慢病毒包裝效率和感染能力比一般病毒低，包裝時產生的空殼病毒（即有病毒外殼，但沒有組裝進目的基因的病毒）比較多。感染細胞時，空殼病毒會競爭細胞表面受體，造成正確感染率下降，因此密度梯度離心、PEG純化法和超濾法等濃縮病毒再感染目的細胞可提高病毒感染效果。